载中药羟基磷灰石/壳聚糖骨支架的制备与生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：中药来源的三七总皂甙苷可通过增加缺血部位血管再生及骨折愈合，因此推测载三七总皂苷的中药支架具有促进骨缺损部位骨痂再生的作用，但其生物相容性尚不清楚。

目的：制备三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖骨修复支架，评估其生物相容性。

方法：采用原位复合和冷冻干燥技术制备载三七总皂苷量分别为0，0.1，1，10 mg的羟基磷灰石/壳聚糖复合材料，采用扫描电镜观察复合支架形貌，并测试其机械性能。①细胞增殖实验：以4种载药羟基磷灰石/壳聚糖复合材料浸提液培养第3代兔骨髓间充质干细胞，以正常培养的细胞为对照，MTT法检测各组细胞A值。②溶血实验：在抗凝兔血中分别加入4种载药羟基磷灰石/壳聚糖复合材料浸提液，酶标仪检测各组A值。③热源实验：经兔耳缘静脉分别注射4种载药羟基磷灰石/壳聚糖复合材料浸提液与生理盐水，检测兔体温升高值。

结果与结论：载药羟基磷灰石/壳聚糖复合材料含有大量直径为110 μm的三维多孔结构，三七总皂苷载药过程对复合材料的孔隙率、孔径、密度无显著影响，但却降低了其断裂强度和弹性模量，载药量越大效果越明显。单纯的羟基磷灰石/壳聚糖复合材料细胞相容性良好，载药后的复合材料明显抑制了细胞增殖，载药量越大效果越明显。载药前后的复合材料均具有良好的血液相容性。载药前后的复合材料均具有一定的热源作用，但符合热源实验的检测合格标准。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 三七总皂苷, 羟基磷灰石, 壳聚糖, 支架, 生物相容性, 骨组织工程, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Panax notoginseng saponins promotes bone repair by improving vascular proliferation. Therefore, the scaffolds carrying panax notoginseng saponins were supposed to be used to improve bone repair at the bone defect region. However, the biocompatibility of scaffolds remains unclear.

OBJECTIVE: To evaluate the biocompatibility of panax notoginseng saponins-hydroxyapatite/chitosan scaffolds.

METHODS: A new bone repair scaffold has been generated by thoroughly mixtures of 0, 0.1, 1, 10 mg panax notoginseng saponins and chitosan/hydroxyapatite using in-situ composite technique and freeze-drying technique. Morphology and mechanical property of the scaffold were observed under a scanning electron microscope. (1) Cell proliferation test: rabbit bone marrow mesenchymal stem cells of passage 3 were cultured in four kinds of drug loaded hydroxyapatite/chitosan composite material leaching liquor. Cells normally cultured were considered as controls. 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl tetrazolium bromide was used to measure absorbance value of cells in each group. (2) Hemolysis test: Rabbit anticoagulated blood was added with four kinds of drug loaded hydroxyapatite/chitosan composite material leaching liquor. Absorbance values were measured using a microplate reader in each group. (3) Pyrogen test: The four kinds of drug loaded hydroxyapatite/chitosan composite material leaching liquor and saline were respectively injected into ear vein of rabbits, and the increase of rabbit body temperature was detected.

RESULTS AND CONCLUSION: Drug loaded hydroxyapatite/chitosan composite material contained three dimensional porous structure of 110 μm in diameter. Drug loading process of panax notoginseng saponins did not significantly affect the porosity, pore size and density of the composite material, but decreased its breaking strength and elastic modulus. The larger amount of drug loading showed a more obvious effect. Simple hydroxyapatite/chitosan composite material had good cellular compatibility. The composite material after drug loading obviously suppressed cell proliferation, and the larger amount of drug loading showed a more obvious effect. The composite material had good blood compatibility before and after drug loading. The composite material had good pyrogen effects before and after drug loading, but accorded with acceptable quality level of pyrogen test.

Key words: biomaterials, material biocompatibility, panax notoginseng saponins, hydroxyapatite, chitosan, scaffold, biocompatibility, bone tissue engineering, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

陈述祥，康乐，区文欢，司徒坚，丁林坚. 载中药羟基磷灰石/壳聚糖骨支架的制备与生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(34): 6116-6122.

Chen Shu-xiang, Kang Le, Ou Wen-huan, Si Tu-jian, Ding Lin-jian. Preparation and biocompatibility of panax notoginseng saponins-hydroxyapatite/ chitosan scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(34): 6116-6122.

图/表（结果） 4

2.1 三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的物理特征和力学性能 由图1可知，采用原位复合和冷冻干燥方法制备的羟基磷灰石/壳聚糖材料色白，随三七总皂苷载药剂量的增加，复合材料的颜色逐渐由淡渐黄。

仿生构建的羟基磷灰石/壳聚糖复合材料具有相互连通的孔隙结构，孔隙率较大，孔径约为110 μm且均匀一致，可为细胞生长提供良好的三维空间结构，见图2；三七总皂苷载药过程对羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的结构无明显影响；但与羟基磷灰石/壳聚糖组比较，1，10 mg三七总皂苷载药剂量却部分降低了材料的力学性能(P < 0.05)，见表1。

2.2 三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的细胞相容性 采用不同组别的材料浸提液和普通DMEM培养低密度接种兔骨髓间充质干细胞48 h，与对照组比较，羟基磷灰石/壳聚糖组并未降低骨髓间充质干细胞的增殖活性，说明羟基磷灰石/壳聚糖复合材料本身无细胞毒性；3个载药组不同程度地降低了骨髓间充质干细胞的增殖活性，且与载药剂量相关，但无明显统计学差异，见表2。
2.3 三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的血液相容性 由表3可知，羟基磷灰石/壳聚糖材料和3个剂量三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖组溶血率介于3.5%-4.5%之间(均低于5%)，且与载药剂量无明显相关性，说明羟基磷灰石/壳聚糖和三七总皂苷载药材料制备工艺安全无毒，所生产的支架材料血液相容性良好，三七总皂苷本身亦无溶血作用。
2.4 三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料对兔体温的影响见表4。

表4 说明经初试和复试后三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖和羟基磷灰石/壳聚糖材料可在一定程度上升高新西兰兔的体温，说明材料具有一定的热源作用，但是体温数据符合热源实验的检测合格标准，另外结合行为观察，新西兰兔在注射浸提液后没有表现出任何不安、焦躁或萎靡等行为，说明所制备的复合材所含热源均符合生物体要求，具有良好的生物相容性。

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引言

材料方法

设计：动物观察实验。

时间及地点：于2011年6月至2012年6月在南方医科大学骨与软骨再生医学实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级雄性新西兰大白兔，体质量 (2 500±300) g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：0052873。

实验方法：

三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的制备^[5-7]：主要参照吴涛^[8-9]相关实验制备方法。将三七总皂苷溶于无水乙醇，将其与壳聚糖加入体积分数2%的乙酸溶液中，搅拌2 h后每隔1 h按Ca/P=1.67分别加入一定质量的Ca(NO₃)₂和KH₂PO₄，最终配成羟基磷灰石/壳聚糖前体溶液(羟基磷灰石/壳聚糖理论生成量质量比为2∶1)，继续搅拌4 h，离心去气泡，然后注入模具，4 ℃冰箱静置6 h后放入-10 ℃冷冻3 h，再进行冻干燥。于室温下将样品在含饱和三七总皂苷的4%NaOH 去离子水中浸泡10 h，继而用含饱和三七总皂苷的去离子水反复浸洗至中性，再次进行冷冻和冷冻干燥得到所需样品。依此法制备载药量分别为0.1，1，10 mg的Φ4.0 mm×15 mm圆柱形三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料。单纯羟基磷灰石/壳聚糖复合材料制备过程中不加入三七总皂苷，亦不用含饱和三七总皂苷的溶剂浸洗。所有支架材料均采用20 kGy ⁶⁰Co辐照灭菌消毒。

载中药羟基磷灰石/壳聚糖骨支架制备与生物相容性实验的主要试剂与仪器：

三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的物理特征和力学性能分析： ①材料形貌采用扫描电镜进行观察：三蒸水漂洗，2%戊二醛固定4 h，系列乙醇逐级脱水，乙酸异戊脂置换，临界点干燥，表面喷金，扫描电镜观察。复合材料的表观密度根据样品的质量/体积计算。孔隙率根据阿基米德原理，采用吸水法测得，计算公式为：孔隙率P = (m₁-m₀)∕(m₁-m₂)；其中，m₀为样品初始质量，m₁为样品浸满水后在空气中的质量，m₂为样品浸满水后在水中的质量^[10]。复合材料的孔径根据扫描电镜观察的至少10个最大及最小孔的有效尺寸计算平均值^[11]。②力学性能分析：采用三点弯曲强度测试羟基磷灰石/壳聚糖材料和三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖材料的断裂强度；将测试样品制备为55 mm×16 mm×15 mm的条状，在室温浸入去离子水1 min，然后于万能材料试验机上对湿态材料的弹性模量进行测试。

三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的生物相容性：

兔骨髓间充质干细胞的分离和培养^[11-12]：取3只成年雄性新西兰大白兔，麻醉后用16号骨穿针行髂骨穿刺，抽取骨髓2 mL，加等量DMEM稀释后接种于75 cm²培养瓶，5 d后半量换液，以后每3 d换液1次，待细胞长至80%融合后消化传代、扩增。取第2代细胞经成骨、成软骨和成脂三向诱导，分别经碱性磷酸酶、阿尔新蓝和油红O染色，鉴定其可转化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，确定其为骨髓间充质干细胞，实验采用第3代细胞进行实验。

MTT法检测细胞增殖^[13-14]：取消毒材料1.5 g，眼科剪剪成碎末状，置于13.5 mL低糖DMEM中37 ℃恒温振荡72 h，20 μm微孔滤膜过滤，加胎牛血清1.5 mL，配成含0.1 g/mL材料浸提液。将兔骨髓间充质干细胞接种至96孔板，2×10³/孔，贴壁后加入150 μL材料浸提液培养，对照组加入普通DMEM培养基培养。48 h后每孔加噻唑蓝20 μL，37 ℃孵育4 h，弃原培养液加DMSO 150 μL，持续振荡10 min，酶标仪570/630 nm检测吸光度(A)。

溶血实验^{[10, 15]}：取消毒材料1.5 g，眼科剪剪成碎末状，置于15 mL生理盐水中37 ℃恒温振荡箱中浸提 72 h，20 μm微孔滤膜过滤备用，加胎牛血清1.5 mL，配成含0.1 g/mL材料浸提液。各实验组在0.2 mL稀释抗凝新西兰兔血中(1∶9生理盐水稀释)加入10 mL材料浸提液，37 ℃水浴60 min。阴性对照组在0.2 mL稀释兔血中加入10 mL生理盐水，阳性对照组在0.2 mL稀释兔血中加入10 mL三蒸水。750×g离心5 min后，取上清 200 μL转移至96孔板，酶标仪545 nm测量吸光度。每组5个样本，计算平均值。

热源实验^[16]：将40只雄性新西兰大白兔随机分配至0.1，1，10 mg三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料组、羟基磷灰石/壳聚糖复合材料组和生理盐水组，每组8只。所有动物在实验前7 d内均饲养在22 ℃饲养室内，健康无伤、肛门清洁、毛发光泽、体温恒定在38.3- 39.3 ℃，经实验前3 h体温测量(1次/60 min)，体温波动均未超过0.2 ℃。所有实验用器械均经250 ℃烘烤 60 min灭除热源，动物在实验前3 h予以禁食，行耳缘静脉穿刺后缓慢注入38 ℃预热的不同浓度三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖材料浸提液、羟基磷灰石/壳聚糖材料浸提液和生理盐水，10 mL/kg，注射后每隔30 min测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数(℃)。结果判断^[4]：在初试的3只兔中，体温升高均低于0.6 ℃，并且3只动物体温升高总和低于1.4 ℃；或在复试的5只动物中，体温升高0.6 ℃或0.6 ℃以上的新西兰兔不超过1只，并且初试复试合并8只动物体温升高总和不超过3.5 ℃，均判断为热源检查合格。

主要观察指标：载药羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的生物相容性。

统计分析：所有数据来自至少3次独立实验；计量资料以x(_)±s表示，各组数据比较采用One way-ANOVA进行分析，LSD法进行两两比较，使用SPSS 17.0软件包对数据进行处理，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

羟基磷灰石是天然骨的主要无机成分，其基本单元-长度为200-400 nm的棒状磷灰石晶体，是发挥骨组织生物学活性的重要结构^[17]。由于羟基磷灰石具有良好的生物活性和生物相容性，植入机体后可发挥良好的骨传导和骨诱导作用，已被广泛用于组织工程研究。壳聚糖是天然的聚阳离子多糖，其结构与细胞外基质中的主要成分糖胺聚糖类似，可促进多种细胞的黏附与功能表达；其降解产物主要为无毒的氨基葡萄糖，生物相容性良好；冷冻干燥制备方法用水作为致孔剂，除可获得良好的孔隙外，还可免除因使用其他致孔剂所带来的毒性^[18]。二者的复合物均已被广泛应用于组织工程材料构建，复合制备工艺比较成熟^[7^，^19-20]。新骨的形成是一个无机物不断在有机质网络上沉积的过程。从仿生学角度来看，对这一过程的模拟将有利于制备出接近生理状态的骨组织工程支架材料。但是，单纯将羟基磷灰石和壳聚糖共混的方法易于出现羟基磷灰石的团聚，难以获得分散均匀的羟基磷灰石/壳聚糖复合材料。原位复合技术是在材料制备成形时通过化学反应或物理作用在材料内部原位生成新相而形成的复合材料^[21-22]，实验采用原位复合方法制备了羟基磷灰石/壳聚糖材料：先将Ca(NO₃)₂和KH₂PO₄与壳聚糖溶液进行混合制备羟基磷灰石/壳聚糖前体溶液，再在模具内壁预先沉积一层壳聚糖膜（复合过程中此膜具有抑制OH^-扩散速度的作用），从而使壳聚糖沉积和前驱体转化为羟基磷灰石的过程缓慢有序进行，同时也为壳聚糖分子链在负电层诱导下的有序沉积提供了模板^{[19, 22]}。当pH值改变时，质子化的壳聚糖分子链在负电层诱导下有序沉积并形成层网状结构，羟基磷灰石前驱体在扩散进来的OH^-作用下原位生成磷酸钙盐，经陈化后转化为羟基磷灰石，从而保证羟基磷灰石以纳米尺寸均匀分散在壳聚糖中，并与壳聚糖一起沉析得到羟基磷灰石/壳聚糖复合材料^[6]。另外，羟基磷灰石/壳聚糖复合材料中羟基磷灰石与壳聚糖含量比值为2∶1，符合天然骨组织中羟基磷灰石的含量比，故该材料在成分上也具有仿生意义。从微观层面上看，纳米羟基磷灰石牢固包裹/嵌合于壳聚糖高分子聚合物之中，虽然材料的载荷主要由羟基磷灰石承担，但由于羟基磷灰石和生物分子可通过静电相互作用、范德华力、氢键、疏水键等作用结合，载荷可以在矿物相和有机相之间传递，故能较好地改善材料的机械性能。另外，材料中纳米级羟基磷灰石晶体尺度极小，可直接被组织细胞摄取；壳聚糖是天然碱性多糖，无毒，可生物降解，因此羟基磷灰石/壳聚糖支架本身亦具有极好的生物活性。随着组织工程学的长足进步，传统的骨缺损治疗正向着基于生物材料联合成骨诱导活性因子的方向转变。然而以骨形态发生蛋白为代表的生长因子是多肽类物质，在体内半衰期短、易于弥散，难以在病损部位形成持续有效的诱导浓度；另外，大剂量给药则可能有潜在的毒性和致癌性等弊端^[23-25]，因此，寻找骨诱导能力强、性质稳定、利于材料制备的成骨活性因子成为了目前骨组织工程研究中的热点。在中国，采用三七和三七组方治疗骨科疾患具有数千年历史，用药独到、简便灵验^[26-28]。三七总皂苷是三七的主要药理活性成分，已有研究表明：三七总皂苷可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化，促进成骨细胞骨保护素的表达^[29-30]；诱导体外条件培养的间充质细胞向成骨细胞分化^[31]；逆转乙醇诱导兔骨髓基质干细胞的成脂分化，进而促进其向成骨细胞分化^[32]。这些研究都论证了三七总皂苷可作为一种骨诱导活性因子的可行性，另外，三七总皂苷熔点高(213 ℃)、易于储存、性质稳定、可耐受⁶⁰Co辐照灭菌，这些都是其构建复合材料的优势。基于此，根据前期细胞学实验结果，实验探索性地构建了载3种剂量的三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料。良好的孔隙结构可为细胞和组织的长入提供三维空间支持，因此构建三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的主要问题在于制备后支架材料性状的保持。在实验中，从材料角度来看，其内部的三七总皂苷会被纳米羟基磷灰石吸附、壳聚糖包裹或散在于材料细微的间隙，这些存在形式可能会对材料的理化性质发生影响。在前期摸索中，Φ4.0×15 mm³圆柱形羟基磷灰石/壳聚糖的最大载药量可达50 mg，而对材料的孔隙结构不发生显著干扰，实验的最大载药量为10 mg。从载药后的扫描电镜结果来看，载药本身并未对材料的密度、孔隙率、孔径发生明显影响；力学性能上，随载药剂量的提高，材料虽在断裂强度和弹性模量上有一定的降低，但是其强度也能基本满足非负重部位的骨修复要求，因此可以断定：不高于10 mg的载药量对构建符合结构和力学要求的羟基磷灰石/壳聚糖支架材料是可行的。从细胞相容性来看，采用材料浸提液培养骨髓间充质干细胞48 h，单纯羟基磷灰石/壳聚糖材料并未显著抑制细胞的增殖，说明材料本身是安全无毒的；载三七总皂苷材料虽然部分抑制了骨髓间充质干细胞的增殖，但是并无统计学差异，结合文献[7]，考虑与材料浸提液中的药物通过促进细胞的分化抑制其增殖有关。考虑到三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料即将用于体内组织构建，采用溶血实验(体外)和热源实验(体内)两种方法对其组织相容性进行了评价。溶血实验表明，单纯羟基磷灰石/壳聚糖复合材料溶血率低，三七总皂苷载药过程对羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的溶血率未发生影响，二者溶血率均低于5%，符合溶血实验合格标准。实验对⁶⁰Co灭菌的三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料进行了热源实验，耳缘静脉注射浸提液后连续检测体温结果表明，实验动物的体温波动符合药典规定的热源实验合格标准。实验结果表明，通过冷冻干燥和原位复合技术可构建出具有三维空间结构和力学要求的三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料，该材料具有良好的生物相容性，这为即将开展的体内成骨实验研究打下了基础。

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延伸阅读

随着组织工程学的长足进步，传统的骨缺损治疗正向着基于生物材料联合成骨诱导活性因子的方向转变。然而以骨形态发生蛋白为代表的生长因子是多肽类物质，在体内半衰期短、易于弥散，难以在病损部位形成持续有效的诱导浓度；另外，大剂量给药则可能有潜在的毒性和致癌性等弊端，因此，寻找骨诱导能力强、性质稳定、利于材料制备的成骨活性因子成为了目前骨组织工程研究中的热点。在中国，采用三七和三七组方治疗骨科疾患具有数千年历史，用药独到、简便灵验。三七总皂苷是三七的主要药理活性成分，已有研究表明：三七总皂苷可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化，促进成骨细胞骨保护素的表达；诱导体外条件培养的间充质细胞向成骨细胞分化；逆转乙醇诱导兔骨髓基质干细胞的成脂分化，进而促进其向成骨细胞分化。这些研究都论证了三七总皂苷可作为一种骨诱导活性因子的可行性，另外，三七总皂苷熔点高（213℃）、易于储存、性质稳定、可耐受钴⁶⁰Co辐照灭菌，这些都是其构建复合材料的优势。基于此，根据前期细胞学实验结果，实验探索性地构建了载三种剂量的三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料。

良好的孔隙结构可为细胞和组织的长入提供三维空间支持，因此构建三七总皂苷-羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的主要问题在于制备后支架材料性状的保持。在实验中，从材料角度来看，其内部的三七总皂苷会被纳米羟基磷灰石吸附、壳聚糖包裹或散在于材料细微的间隙，这些存在形式可能会对材料的理化性质发生影响。在前期摸索中, Φ4.0×15mm³圆柱形羟基磷灰石/壳聚糖的最大载药量可达50mg，而对材料的孔隙结构不发生显著干扰，实验的最大载药量为10mg。从载药后的扫描电镜结果来看，载药本身并未对材料的密度、孔隙率、孔径发生明显影响；力学性能上，随载药剂量的提高，材料虽在断裂强度和弹性模量上有一定的降低，但是其强度也能基本满足非负重部位的骨修复要求，因此可以断定：不高于10mg的载药量对构建符合结构和力学要求的羟基磷灰石/壳聚糖支架材料是可行的。